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NADH不能直接进入线粒体呼吸链发挥作用。
呼吸链主要存在于线粒体内膜，而细胞质中产生的NADH由于无法穿透线粒体内膜，必须通过特定转运机制进入。在哺乳动物细胞中，糖酵解产生的NADH需要通过甘油-3-磷酸穿梭或苹果酸-天冬氨酸穿梭系统，将其携带的电子转移给线粒体内的FAD或NAD+，最终形成FADH2或线粒体基质内的NADH参与后续反应。
外源性补充的NADH面临更复杂的生物利用问题。口服摄入的NADH在消化道中易被分解为烟酰胺等小分子，经吸收后需在细胞内重新合成NADH。即便通过特殊工艺提高稳定性，NADH分子较大的极性和电荷特性也限制其跨膜运输效率。目前未有明确证据表明外源NADH能完整进入线粒体直接参与电子传递，其作用更多体现在提升细胞整体NAD+水平，间接支持能量代谢。
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