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NADH可以在线粒体基质和内膜系统中直接生成。
线粒体基质内的三羧酸循环是NADH主要合成场所，异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶催化反应时，直接将电子传递给NAD+形成NADH。每个葡萄糖分子经过完整代谢可在基质中产生8分子NADH，这些还原态物质立即结合复合体I进入电子传递链。基质内NADH浓度直接影响氧化磷酸化效率，其生成速率受丙酮酸脱氢酶复合体活性调控。
线粒体内膜上的反向电子传递过程也能产生NADH。当琥珀酸脱氢酶将电子传递给辅酶Q时，部分能量驱动质子泵反向运转，促使复合体I将电子逆向传递给NAD+。这种机制在细胞能量过剩时帮助维持氧化还原平衡，防止自由基过量产生。线粒体自主合成的NADH不依赖胞质穿梭系统，可直接参与ATP合成酶的功能调节。
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