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NADH不能直接穿过线粒体内膜，需借助特定穿梭机制传递还原当量。
线粒体内膜具有高度选择性通透性，NADH因其分子极性和电荷特性无法自由穿透。细胞质中糖酵解产生的NADH需通过苹果酸-天冬氨酸穿梭或α-磷酸甘油穿梭系统，将电子转移给线粒体内的FAD或NAD+，最终形成可参与呼吸链的FADH₂或线粒体基质内的NADH。
外源性补充的NADH同样无法直接进入线粒体发挥作用。口服或注射的NADH在体内会被分解为烟酰胺等小分子，需通过细胞内的生物合成途径重新生成NADH。临床应用中，NADH相关产品通过优化吸收路径和代谢支持间接改善能量代谢，在规范剂量下安全有效，但需遵循专业指导以确保作用路径的完整性。
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