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每个NADH分子在真核生物细胞呼吸中可产生约2.5个ATP。
NADH通过电子传递链（ETC）和氧化磷酸化生成ATP，这一过程依赖线粒体内膜上的质子梯度。当NADH将电子传递给复合体I时，质子被泵入线粒体膜间隙，形成电化学势能。ATP合成酶利用质子回流的力量催化ADP与磷酸结合生成ATP。研究表明，每分子NADH释放的电子可驱动生成约2.5个ATP，这一数值反映了质子泵送效率与ATP合成酶活性的综合作用。
实际产量可能因细胞类型和环境条件波动。例如，糖酵解产生的NADH需通过甘油-3-磷酸穿梭进入线粒体，此过程可能导致部分能量损耗，最终生成约1.5-2.5个ATP。相比之下，线粒体内直接生成的NADH（如三羧酸循环产物）因无需跨膜转运，能量转化效率更高。此外，质子梯度除用于ATP合成外，还可能参与线粒体物质运输或产热，进一步影响最终ATP净产量。
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