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NADH不能自由进入线粒体，需通过特定转运系统完成跨膜运输。
线粒体内膜对NADH具有高度选择性，其双层膜结构阻碍大分子带电物质直接穿透。NADH必须依赖苹果酸-天冬氨酸穿梭或甘油磷酸穿梭系统完成跨膜转移，前者将还原当量转化为苹果酸进行转运，后者通过甘油-3-磷酸脱氢酶实现电子传递。心脏和肝脏组织主要采用苹果酸穿梭，肌肉组织则依赖甘油磷酸穿梭，两种方式均会造成约30%的还原当量损失。
外源性补充的NADH无法直接进入线粒体发挥作用。口服NADH在消化道会被分解为烟酰胺和腺嘌呤，需经细胞重新合成才能参与能量代谢。研究显示，静脉注射的NADH生物利用率不足5%，因其无法有效穿透细胞膜。提升线粒体NADH水平的有效方法包括补充前体物质如烟酸、色氨酸，或使用α-硫辛酸增强线粒体膜稳定性。临床干预更关注改善电子传递链效率，而非直接输送NADH。
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