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NADH可以在线粒体中生成。
线粒体是细胞内NADH生成的核心场所。在三羧酸循环中，丙酮酸经过脱羧反应形成乙酰辅酶A，随后通过一系列酶促反应彻底氧化为二氧化碳，同时将高能电子传递给NAD+生成NADH。这一过程发生在线粒体基质内，每轮循环可产生3分子NADH。此外，脂肪酸氧化和氨基酸代谢的中间产物也会进入线粒体，通过类似途径生成NADH。
线粒体内膜上的电子传递链是NADH发挥功能的关键区域。由三羧酸循环产生的NADH将电子传递给复合体Ⅰ，驱动质子泵建立跨膜质子梯度，最终通过ATP合酶合成ATP。研究表明，线粒体NADH还参与铁硫簇的生物合成，维持酶活性并影响线粒体功能。这些过程紧密关联，共同支撑细胞的能量代谢和氧化还原稳态。
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