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每个NADH分子通过电子传递链可产生约2.5-3个ATP。
NADH在线粒体电子传递链中通过氧化磷酸化驱动ATP合成。其携带的高能电子经复合体I、III、IV逐级传递，释放的能量将质子泵入线粒体膜间隙形成电化学梯度。当质子通过ATP合酶回流基质时，每4个质子流可合成1个ATP。由于线粒体内膜存在质子泄漏和能量损耗，实际每分子NADH仅能生成2.5-3个ATP，而非理论上的3个。
NADH来源不同直接影响产能效率。线粒体内生成的NADH（如三羧酸循环产物）直接参与氧化磷酸化，而细胞质中糖酵解产生的NADH需通过甘油-3-磷酸穿梭或苹果酸-天冬氨酸穿梭进入线粒体，此过程可能损失能量，使每个NADH仅产生1.5-2.5个ATP。细菌等原核生物因无需跨膜运输，NADH产能效率可达3个ATP。
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