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NADH不能直接通过线粒体内膜，需依赖特定穿梭机制间接进入。
线粒体内膜对NADH的通透性极低，其物理结构和化学特性阻止了小分子直接扩散。内膜富含蛋白质复合体并具有高度选择性，NADH作为带负电的大分子无法自由穿透脂质双层。此时，细胞通过两种主要穿梭系统——苹果酸-天冬氨酸穿梭和3-磷酸甘油穿梭，将胞质中的NADH还原当量传递至线粒体内。
以苹果酸-天冬氨酸穿梭为例，胞质中的NADH先将电子转移给草酰乙酸生成苹果酸，苹果酸经内膜载体进入线粒体基质后被重新氧化为草酰乙酸并再生NADH。该过程依赖多种酶和转运蛋白的协同作用，确保电子高效进入呼吸链。这种间接转运机制既解决了通透性限制，又维持了内膜两侧的质子梯度，为ATP合成提供能量基础。
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